细胞接种及凝胶制备凝胶

1、按照10⁵ -10⁷ cells/mL细胞密度准备0.5mL细胞悬液。

2、将细胞培养板置于冰上预冷。

3、将0.5mL的2X 3D Culturing gel置于37℃水浴锅5-10分钟以便充分溶解。溶解后，将胶与细胞充分混匀后，加入细胞培养板中。

4、5分钟后，加入预冷的 1X Covering Buffer，盖过凝胶顶部。

5、15分钟后，小心将 1X Covering Buffer更换为细胞培养基。

6、培养细胞1至2周。为了保证细胞正常生长，可每两天更换培养基。

溶解及球体收集

1、吸除培养基，用1×PBS轻轻冲洗凝胶顶部。

2、吸除1×PBS，加入1X Dissociating Buffer，盖过凝胶顶部，室温下5分钟。

3、轻轻吸取吹打液体直至胶体完全溶解。加入3倍体积1×PBS，然后将培养孔中溶液转移至1.5mL无菌离心管中。

4、1000 rpm离心10分钟，弃上清，收集球体用于后续实验或分析。

5、为了分离单个细胞，将胰蛋白酶- EDTA加入球体中，37℃孵育。轻轻吹打，直至球体解离，加入3倍体积1× PBS。

6、1000 rpm离心5分钟，弃上清，收集细胞用于后续实验或分析。

注意事项

1）建议使用24孔板培养细胞，每孔加入20-40 μL凝胶。

2）为了确保移液易操作、凝胶结构均匀，并防止培养过程中凝胶脱落，使用前有必要在37℃的水浴中充分溶解凝胶。

3 ）缓冲液在使用前应进行稀释。10X Covering Buffer用无血清DMEM培养基进行稀释，10X Dissociating Buffer 用1 X PBS进行稀释。

4）往培养孔中加入Covering Buffer前，实验者可用移液管尖端轻触凝胶以测试凝胶的形成情况。从凝胶表面收回尖端时不得拔出凝胶线即可。

5）进行肿瘤侵袭实验时，一般建议用0.5X Covering Buffer按照1:14比例稀释 1X 3D Culturing Gel（即3D Culturing Gel稀释15倍）。根据细胞类型调整稀释倍数。另外，为避免在Covering Buffer移除时破坏薄凝胶层，建议将Covering Buffer覆盖凝胶后在4℃下孵育过夜，然后直接将无血清癌细胞悬液加入到Transwell的上室中。